Кріоелектронну мікроскопію використано для виявлення структурних змін, які тимчасово відключають синтез РНК

Дослідники з'ясували механізм призупинення транскрипції у деяких бактерій, визначивши структури РНК-полімерази в комплексі зі шаблоном ДНК, продуктом РНК і білковим фактором за допомогою кріоелектронної мікроскопії (кріо-ЕМ).

Малюнок: Цикл приєднання нуклеотидів бактеріальної РНК-полімерази (RNAP) зображено за допомогою мультиплікаційних моделей шаблонної ДНК (tDNA, зелений), РНК (RNA, червоний), тригерної петлі (TL, пурпурний), брускової спіралі (BH, синій), вхідного NTP (червоний) і Mg2+ (жовті сфери) разом з конформаційними змінами RNAP (поворот, складання тригерної петлі), пов'язаними з кожним кроком циклу приєднання нуклеотидів. Взаємодія NusG і нешаблонної ДНК (ntDNA, світло-зелений) (центральна панель) інгібує поворот РНК-полімерази, складання тригерної петлі алостерично, тим самим припиняється синтез РНК. Credit: Proceedings of the National Academy of Sciences (2023). DOI: 10.1073/pnas.2218516120

Точний контроль експресії генів - забезпечення того, щоб клітини виробляли потрібні компоненти в потрібній кількості та в потрібний час - життєво важливий для нормального функціонування всіх організмів. Клітини повинні регулювати, як гени, закодовані в послідовності ДНК, перетворюються на молекули РНК, які можуть виконувати клітинні функції самостійно або бути далі переробленими в білки.

Одним зі способів регуляції експресії генів є призупинення "транскрипції" - процесу, під час якого РНК синтезується з шаблону ДНК ферментом, що називається РНК-полімеразою. Тепер дослідники з'ясували механізм призупинення транскрипції у деяких бактерій за допомогою кріоелектронної мікроскопії (кріо-ЕМ), що дає змогу визначити в атомному масштабі структуру РНК-полімерази до, під час і відразу після паузи у виробництві РНК. З'ясування механізму призупинення транскрипції має вирішальне значення для розуміння основних клітинних функцій, розповідають в Пенсильванському державному університеті.

Одним з ключових компонентів призупинення транскрипції у бактерій є білковий фактор під назвою NusG, що зберігається в усіх організмах, включно з людиною, тож, як зазначають автори дослідження, виявлений у данній роботі механізм призупинення може бути широко застосований для розуміння регуляції генів у всіх організмах на Землі. Отримані дані також можуть бути використані для виявлення нових антибактеріальних агентів, які націлені на призупинення транскрипції та інгібують її, порушуючи тим самим правильну експресію генів і клітинні функції.

Стаття, що описує дослідження групи вчених з Пенсільванського університету, була опублікована 6 лютого в журналі Proceedings of the National Academy of Sciences ("Праці Національної академії наук").

Також цікаво: науковці виявили ген деескалації агресії, але поки що лише у плодових мушок.

"Для нормального функціонування, клітини повинні точно контролювати експресію генів, щоб гарантувати, що вони продукують вибрані білки та функціональні РНК у потрібній кількості та в потрібний час", - каже Кастухіко Муракамі, професор біохімії та молекулярної біології, один з керівників дослідницької групи.

"Експресія генів може регулюватися безліччю способів, навіть коли РНК-полімераза активно продукує РНК, наприклад, призупиненням транскрипції. Тут ми використовували кріо-ЕМ визначення структури та біохімічні аналізи на основі структури, щоб визначити взаємодії між РНК-полімеразою, ДНК та NusG, а також структурні зміни РНК-полімерази, які відбуваються, коли РНК-полімераза робить паузу під час транскрипції", - вказав професор Муракамі.

РНК-полімераза - це молекулярна машина, що складається з кількох функціональних доменів. Вона також взаємодіє з низкою інших білкових кофакторів, які допомагають регулювати час і кількість вироблення РНК. Робота в лабораторії Пола Бабіцке, професора молекулярної біології та керівника дослідницької групи, показала, що один із цих кофакторів, білок під назвою NusG, має вирішальне значення для призупинення транскрипції.

"Ми експериментально показали, що NusG відіграє важливу роль у призупиненні транскрипції, розпізнаючи специфічний мотив короткої послідовності ДНК", - каже Бабіцке.

"Ми виявили понад 1600 таких мотивів послідовності в геномі бактерії Bacillus subtilis, які беруть участь у NusG-залежному призупиненні транскрипції. ДНК є дволанцюговою, і тільки одна нитка, звана ниткою шаблону, транскрибується в РНК. Цікаво, що розпізнавальний мотив для NusG розташований на нешаблонній нитці. Щоб зрозуміти, як взаємодія NusG з нешаблонною ДНК може призвести до паузи, ми хотіли подивитися, що може відбуватися зі структурою комплексу. Кріо-ЕМ дозволила нам зробити саме це", - розповів він.

Дослідницька група визначила послідовності ДНК і РНК, які спричиняють призупинення транскрипції в присутності NusG, а потім відновила транскрипційний комплекс, використовуючи ДНК, РНК і NusG разом з РНК-полімеразою. Зразки були заморожені, а потім використані для структурних досліджень методом кріо-ЕМ за допомогою сучасної установки кріоелектронної мікроскопії в Інституті наук про життя ім. Хака при Пенсильванському університеті.

У структурі призупиненого транскрипційного комплексу команда виявила, що NusG взаємодіє з нешаблонною ниткою ДНК, вставляючи її у вузьку порожнину між NusG і доменом РНК-полімерази, так званою бета-долею. Але ця взаємодія відбувається далеко від активного сайту РНК-полімерази, тож як же вона призводить до призупинення транскрипції? Для вирішення цього питання дослідницька група використала унікальну інформацію, отриману під час кріо-ЕМ структурного дослідження.

"Коли ми заморожуємо зразок, відновлені транскрипційні комплекси можуть перебувати на різних стадіях процесу транскрипції", - каже Ріші К. Вішвакарма, асистент професора біохімії та молекулярної біології Пенсільванського університету та перший автор статті. "За допомогою кріо-ЕМ ми можемо використовувати дані одного зразка для визначення серії структур, що показують різні стадії паузи в транскрипції, а потім послідовно розташувати ці структури. Ми використовували їх для реконструкції фільму про транскрипційні комплекси, щоб спостерігати, що відбувається з транскрипційним комплексом, коли транскрипція призупиняється, подібно до того, як перекидний календар може уявити рух із серії нерухомих зображень."

"Знадобився деякий час, щоб з'ясувати, як взаємодія NusG і нешаблонної ДНК призупиняє транскрипцію", - каже Муракамі.

Він розповідає: "Одного дня, коли я дивився фільм про транскрипційні комплекси, визначені в цій роботі, я помітив, що велика конформаційна зміна РНК-полімерази - обертання поворотного модуля - пов'язана зі згортанням петлі, необхідною конформаційною зміною РНК-полімерази для синтезу РНК. Коли нешаблонна ДНК опиняється в пастці між NusG і бета-часткою РНК-полімерази, вона перешкоджає обертанню поворотного модуля, тим самим заважаючи згортанню тригерної петлі та синтезу РНК, нібито щось застрягло в одній із шестерень двигуна, що вплинуло б на інші частини двигуна і зупинило б машину. Я був дуже схвильований цією знахідкою і не міг перестати дивитися фільм, поки мої ідеї зміцнювалися".

Оскільки призупинення транскрипції є тимчасовим механізмом зупинки синтезу РНК, команда також вивчила структурні зміни транскрипційного комплексу під час виходу з паузи, приготувавши зразок, який містив призупинений транскрипційний комплекс і субстрат РНК-полімерази (NTP), і визначивши кріо-ЕМ структури.

У транскрипційному комплексі, що вийшов з паузи, нешаблонна ДНК більше не була затиснута між NusG і бета-часткою РНК-полімерази, що дало змогу поворотному модулю знову обертатися так, щоб тригерна петля могла складатися правильно.

"Оскільки більшість компонентів цього процесу збереглися від бактерій до людини, нам цікаво дізнатися, чи зберігся механізм", - каже Муракамі.

Він додав, що триває праця з іншими клітинними РНК-полімеразами, зокрема, з архей та еукаріотів.

на русском языке